Suriyamas 1 ผลของฟรักโทสในฐานะตัวยับยั้งในการไฮโดรไลซิสแล็กโทส คำถามการวิจัย: ฟรักโทสที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (0.00 mM, 20.00 mM, 40.00 mM, 60.00 mM, 80.00 mM และ 100.00 mM) ยับยั้งการไฮโดรไลซิส o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) โดยเอนไซม์แล็กเทสที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 20 นาทีอย่างไร เมื่อวัดจากค่าการดูดกลืนแสงที่ 420 nm ด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ บทนำและข้อมูลพื้นฐาน: แล็กเทสเป็นเอนไซม์ย่อยอาหารที่จำเป็น ซึ่งสร้างขึ้นที่บริเวณขอบแปรง (brush border) ของลำไส้เล็ก และไฮโดรไลซ์แล็กโทสให้เป็นมอโนแซ็กคาไรด์ที่ร่างกายดูดซึมได้ ได้แก่ กลูโคสและกาแล็กโทส (Goosenberg and Afzal) แล็กโทสเป็นไดแซ็กคาไรด์ที่พบได้ทั่วไปในผลิตภัณฑ์นม เช่น นมและเนยแข็ง อย่างไรก็ตาม บุคคลบางรายเกิดภาวะแพ้แล็กโทส (lactose intolerance) ขึ้นในช่วงชีวิตเนื่องจากการสร้างแล็กเทสลดลง ซึ่งมักเป็นผลมาจากการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรมที่ลดการแสดงออกของยีนที่กำหนดการสร้างแล็กเทส (MedlinePlus) ภาวะพร่องนี้ทำให้การย่อยแล็กโทสบกพร่อง และนำไปสู่อาการทางระบบทางเดินอาหาร เช่น ท้องอืด ปวดท้อง และท้องร่วง (Goosenberg and Afzal) น้ำตาลอีกชนิดหนึ่งที่บริโภคกันทั่วไปคือฟรักโทส ซึ่งพบในผลไม้ น้ำผึ้ง และผักบางชนิด ที่น่าสังเกตคือ มีงานวิจัยที่ระบุว่าฟรักโทสเป็นตัวยับยั้งแบบแข่งขันของแล็กเทส (Song et al.) เนื่องจากโครงสร้างที่คล้ายคลึงกับแล็กโทสทำให้ฟรักโทสสามารถจับกับบริเวณเร่งของเอนไซม์ได้ ด้วยเหตุนี้ ฟรักโทสจึงแข่งขันกับแล็กโทสโดยตรงในการจับกับแล็กเทส ส่งผลให้การจับของแล็กโทสลดลง และทำให้อัตราการไฮโดรไลซิสแล็กโทสลดลงตามไปด้วย (VanDee et al.) นอกจากนี้ แล็กเทสทำงานได้ดีที่สุดภายใต้สภาวะที่ใกล้เคียงกับลำไส้เล็กของมนุษย์ คือ pH เป็นกรดเล็กน้อยถึงเป็นกลางที่ 6.0-7.0 และอุณหภูมิ 37°C (Verducci) สภาวะเหล่านี้จะถูกควบคุมให้คงที่ในฐานะตัวแปรควบคุมตลอดการศึกษานี้ เพื่อแยกผลของความเข้มข้นของฟรักโทสที่มีต่อกิจกรรมของเอนไซม์ การศึกษานี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อตรวจสอบผลของความเข้มข้นของฟรักโทสที่เพิ่มขึ้นต่อการย่อยแล็กโทสโดยแล็กเทส เพื่อให้สามารถวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์นี้ในเชิงปริมาณได้ การศึกษานี้จะใช้ o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ONPG เป็นสารประกอบสังเคราะห์ที่คล้ายคลึงกับแล็กโทส ซึ่งแล็กเทสสามารถไฮโดรไลซ์ได้ และนิยมใช้อย่างแพร่หลายในการทดสอบทางวิทยาศาสตร์ (Leksmono et al.) เมื่อ ONPG ถูกไฮโดรไลซ์โดยแล็กเทส จะได้ D-galactose และออร์โท-ไนโตรฟีนอล (ดูภาพที่ 1) ซึ่งเป็นสารประกอบสีเหลืองที่ดูดกลืนแสงได้มากที่ 420 nm (Leksmono et al.) ภาพที่ 1 - การไฮโดรไลซิส ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside (Leksmono et al.) ดังนั้น จึงสามารถวัดอัตราการไฮโดรไลซิส ONPG ในเชิงปริมาณได้โดยวัดการเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงที่ 420 nm ด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ โดยค่าการดูดกลืนแสงที่สูงขึ้นสอดคล้องกับการผลิตออร์โท-ไนโตรฟีนอลที่มากขึ้นและกิจกรรมของแล็กเทสที่สูงขึ้น ขณะที่ค่าการดูดกลืนแสงที่ต่ำลงแสดงถึงการเกิดออร์โท-ไนโตรฟีนอลที่ลดลงและกิจกรรมของเอนไซม์ที่ลดลง
Suriyamas 2 สมมติฐาน: สมมติฐานว่าง (H0): การเพิ่มความเข้มข้นของฟรักโทสในสารละลายจะไม่มีผลต่อการไฮโดรไลซิส ONPG โดยเอนไซม์แล็กเทส เนื่องจากฟรักโทสไม่มีอิทธิพลต่อกิจกรรมของแล็กเทสภายใต้สภาวะการทดลอง สมมติฐานทางเลือก (Ha): หากความเข้มข้นของฟรักโทสในสารละลายเพิ่มขึ้น การไฮโดรไลซิส ONPG โดยแล็กเทสจะลดลง ทั้งนี้เนื่องจากฟรักโทสทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งแบบแข่งขัน โดยแข่งขันกับ ONPG ในการจับกับบริเวณเร่งของแล็กเทส และลดการเกิดสารเชิงซ้อน ONPG-แล็กเทส จึงทำให้การเกิดผลิตภัณฑ์ลดลง (VanDee et al.) ดังนั้น ความเข้มข้นของฟรักโทสสูงสุด (100.00 mM) จะให้ค่าการดูดกลืนแสงต่ำที่สุด ตัวแปร: ช่วง การจัดกระทำ ตัวแปรต้น: ความเข้มข้นของฟรักโทส 0.00 mM, 20.00 mM, 40.00 mM, 60.00 mM, 80.00 mM และ 100.00 mM ความเข้มข้นเหล่านี้คือความเข้มข้นของฟรักโทสในสารละลายปฏิกิริยาสุดท้าย ดูหัวข้อวิธีการ ภายใต้หัวข้อการเตรียมสารละลาย ในส่วน “สารละลายฟรักโทส” ตัวแปรตาม: ค่าการดูดกลืนแสง (AU) ของออร์โท-ไนโตรฟีนอลที่ 420 nm การวัด: วัดค่าการดูดกลืนแสงด้วยสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ Vernier Go Direct SpectroVis Plus ที่ปรับเทียบที่ 420 nm ตัวแปรควบคุม อะไร เหตุผล วิธีการ ความเข้มข้นและปริมาตรของ ONPG และแล็กเทส การรักษาความเข้มข้นของ ONPG และแล็กเทสให้คงที่ทำให้มั่นใจได้ว่าการเปลี่ยนแปลงของค่าการดูดกลืนแสงสะท้อนถึงการยับยั้งโดยฟรักโทส ไม่ใช่ความแปรผันของซับสเตรตหรือเอนไซม์ ดู “สารละลายแล็กเทส 0.01%” และ “สารละลาย ONPG (5mM)” ภายใต้หัวข้อการเตรียมสารละลายในส่วนวิธีการ pH ของสารละลาย การรักษา pH ไว้ที่ 7 ทำให้มั่นใจได้ว่ากิจกรรมของแล็กเทสไม่ได้รับผลกระทบจากการเปลี่ยนแปลงของ pH จึงแยกผลของฟรักโทสที่มีต่อการไฮโดรไลซิส ONPG ได้ (Popescu et al.) สารละลายตั้งต้นทั้งหมดเตรียมโดยใช้บัฟเฟอร์ pH 7 อุณหภูมิของสารละลาย แล็กเทสทำงานได้ดีที่สุดที่ 37 °C การเบี่ยงเบนจากอุณหภูมินี้ส่งผลต่อประสิทธิภาพของเอนไซม์ จึงเปลี่ยนปริมาณออร์โท-ไนโตรฟีนอลที่ผลิตได้ และส่งผลต่อค่าการดูดกลืนแสงตามมา ใช้ระบบให้ความร้อนแบบสองชั้น (double boiler) เพื่อรักษาอุณหภูมิของสารละลายไว้ที่ 37 °C (เนื่องจากไม่มีอ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ) โดยใช้เทอร์มอมิเตอร์ติดตามอุณหภูมิตลอดการทดลอง เวลาที่ให้เกิดปฏิกิริยา เวลาที่นานขึ้นหรือสั้นลงจะเปลี่ยนปริมาณ o-nitrophenol ที่ผลิตได้ จึงทำให้ค่าการดูดกลืนแสงที่วัดได้เปลี่ยนไป ทุกการทดลองให้เกิดปฏิกิริยาเป็นเวลาคงที่ 20 นาที โดยใช้นาฬิกาจับเวลาแบบดิจิทัล ก่อนวัดค่าการดูดกลืนแสง
Suriyamas 3 วัสดุและอุปกรณ์: ชื่ออุปกรณ์ จำนวน ความไม่แน่นอน o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 0.250g - เอนไซม์แล็กเทส (CAS # 9031-11-2) 0.200g - ฟรักโทส (CAS # 57-48-7) 20.000g - สารละลายบัฟเฟอร์ pH 7 250 mL - น้ำกลั่น 1 L - บีกเกอร์ขนาด 50 mL 5 - บีกเกอร์ขนาด 250 mL 2 - บีกเกอร์ขนาด 600 mL 1 - บีกเกอร์ขนาด 2000 mL 1 - หลอดทดลองขนาด 25 mL 9 - เทอร์มอมิเตอร์ 1 ± 0.5°C แท่งแก้วคน 1 - ปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL 2 ± 0.04 mL ลูกยางดูดปิเปตต์ 2 - กระบอกตวงขนาด 100 mL 1 ± 0.5 mL กระบอกตวงขนาด 10 mL 1 ± 0.05 mL เครื่องชั่งดิจิทัล (พิกัด 120 g) 1 ± 0.001 g นาฬิกาจับเวลาแบบดิจิทัล 1 ± 0.01 s ไมโครปิเปตต์ (100 - 1000μL) 1 ± 2.5 μL ปลายไมโครปิเปตต์ 8 - สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ Vernier Go Direct SpectroVis Plus 1 ± 0.001 AU คอมพิวเตอร์โน้ตบุ๊กที่ติดตั้งซอฟต์แวร์ Vernier Spectral Analysis 1 - เตาให้ความร้อน (hot plate) 1 - แผ่นอะลูมิเนียมฟอยล์ 30×40 cm - ถ้วยชั่งสาร 1 - ช้อนตักสาร 1 - เทปกาวย่น 1 ม้วน - ปากกาเคมีชนิดลบไม่ออก 1 -
Suriyamas 4 วิธีการ: การติดฉลากอุปกรณ์ 1. ติดฉลากปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL สองอันแยกกันว่า “บัฟเฟอร์” และ “น้ำกลั่น” การเตรียมสารละลาย สารละลายฟรักโทส 1. วางถ้วยชั่งสารที่สะอาดบนเครื่องชั่งดิจิทัลและตั้งค่าให้เป็นศูนย์ 2. ชั่งฟรักโทส 1.440 g โดยใช้ช้อนตักสาร แล้วถ่ายลงในบีกเกอร์ขนาด 50 mL 3. เติมบัฟเฟอร์ pH 7 ปริมาตร 20 mL โดยใช้ปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL ที่ติดฉลาก “บัฟเฟอร์” สองครั้ง 4. คนด้วยแท่งแก้วคนจนอนุภาคที่มองเห็นได้ละลายหมด 5. เติมน้ำกลั่น 20 mL โดยใช้ปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL ที่ติดฉลาก “น้ำกลั่น” ถ่ายต่อเนื่องกัน และคนด้วยแท่งแก้วคนเป็นเวลา 30 วินาที 6. ใช้เทปกาวย่นและปากกาเคมีติดฉลากบีกเกอร์ว่า “ฟรักโทส 20.00 mM” 7. ล้างและเช็ดแท่งแก้วคน ช้อนตักสาร และถ้วยชั่งสารให้แห้งโดยใช้น้ำกลั่นและกระดาษเช็ดมือ 8. ทำซ้ำขั้นตอนที่ 2-6 สำหรับความเข้มข้นที่เหลือ ได้แก่ 2.880 g สำหรับ 40.00 mM, 4.320 g สำหรับ 60.00 mM, 5.770 g สำหรับ 80.00 mM และ 7.210 g สำหรับ 100.00 mM ติดฉลากบีกเกอร์แต่ละใบให้สอดคล้องกัน (ดูภาพที่ 2) ภาพที่ 2 - สารละลายฟรักโทสที่เตรียมไว้ (โดยผู้วิจัย) สารละลายแล็กเทส (0.01%) 1. วางถ้วยชั่งสารที่สะอาดบนเครื่องชั่งดิจิทัลและตั้งค่าให้เป็นศูนย์ 2. ชั่งผงแล็กเทส 0.100 g โดยใช้ช้อนตักสาร แล้วถ่ายลงในบีกเกอร์ขนาด 250 mL 3. ใช้ปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL ที่ติดฉลาก “น้ำกลั่น” ชะล้างถ้วยชั่งสารด้วยน้ำกลั่นเพื่อรวบรวมผงที่เหลือลงในบีกเกอร์ 4. ใช้ปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL ที่ติดฉลาก “น้ำกลั่น” เติมน้ำกลั่น 50 mL โดยถ่ายต่อเนื่องกัน คนด้วยแท่งแก้วจนละลายหมด 5. ใช้ปิเปตต์แบบปริมาตรขนาด 10 mL ที่ติดฉลาก “บัฟเฟอร์” เติมสารละลายบัฟเฟอร์ pH 7 ปริมาตร 50 mL โดยถ่ายต่อเนื่องกัน คนด้วยแท่งแก้วเป็นเวลา 10 วินาที 6. ติดฉลากบีกเกอร์ว่า “สารละลายแล็กเทส” 7. ล้างและเช็ดแท่งแก้วคน ช้อนตักสาร และถ้วยชั่งสารให้แห้งโดยใช้น้ำกลั่นและกระดาษเช็ดมือ
Suriyamas 5 สารละลาย ONPG (5 mM) 1. วางถ้วยชั่งสารที่สะอาดบนเครื่องชั่งดิจิทัลและตั้งค่าให้เป็นศูนย์ 2. ชั่งผง ONPG 0.250 g แล้วถ่ายลงในบีกเกอร์ขนาด 250 mL 3. ตวงสารละลายบัฟเฟอร์ pH 7 ปริมาตร 83 mL โดยใช้กระบอกตวงขนาด 100 mL แล้วเติมลงในบีกเกอร์ 4. คนด้วยแท่งแก้วคนจนละลายหมด 5. ล้างกระบอกตวงด้วยน้ำกลั่นให้ทั่ว 6. ใช้กระบอกตวงอันเดิมตวงน้ำกลั่น 83 mL แล้วเติมลงในบีกเกอร์ คนให้เข้ากัน 7. ติดฉลากบีกเกอร์ว่า “สารละลาย ONPG 5 mM” การจัดระบบให้ความร้อนแบบสองชั้น 1. ขยำแผ่นอะลูมิเนียมฟอยล์ขนาด 30×40 cm ให้เป็นแผ่นกลมขนาด 6×2 cm เพื่อใช้เป็นฐานรอง (ดูภาพที่ 3) 2. เติมน้ำประปา 200 mL ลงในบีกเกอร์ขนาด 2000 mL และวางฐานรองฟอยล์ไว้ตรงกลาง 3. วางบีกเกอร์ขนาด 600 mL ที่บรรจุน้ำประปา 400 mL ลงบนฐานรองภายในบีกเกอร์ขนาด 2000 mL 4. ใช้กระบอกตวงขนาด 10 mL สองครั้ง ถ่ายสารละลายแต่ละชนิด (ONPG แล็กเทส สารละลายฟรักโทสทั้งห้าชนิด น้ำกลั่น และน้ำประปา) ปริมาตร 15 mL (10 + 5) ลงในหลอดทดลองขนาด 25 mL ที่ติดฉลากแยกกัน วางหลอดทดลองทั้งหมดลงในบีกเกอร์ขนาด 600 mL 5. เสียบเทอร์มอมิเตอร์ลงในหลอดทดลองที่บรรจุน้ำประปาเพื่อใช้เป็นหลอดอ้างอิง 6. วางบีกเกอร์ขนาด 2000 mL บนเตาให้ความร้อนและตั้งค่าที่ระดับต่ำสุด เมื่อเทอร์มอมิเตอร์ในหลอดทดลองอ้างอิงอ่านค่าได้ 37 °C สารละลายทั้งหมดจะพร้อมใช้งาน (ดูภาพที่ 4) ภาพที่ 3 - ฐานรองอะลูมิเนียมฟอยล์ (โดยผู้วิจัย) ภาพที่ 4 - การจัดระบบให้ความร้อนแบบสองชั้น (โดยผู้วิจัย)
Suriyamas 6 การจัดเตรียมเพื่อป้องกันการสับสนและการปนเปื้อนข้าม 1. วางแถบเทปกาวย่นยาว 30 cm บนโต๊ะปฏิบัติการและติดฉลากตามภาพที่ 5 2. วางกระดาษทิชชูที่สะอาดไว้ข้างเทป และวางปลายไมโครปิเปตต์ที่สะอาดหนึ่งอันไว้หน้าฉลากแต่ละอัน ในขั้นตอนปฏิบัติทั้งหมดต่อจากนี้ ต้องเปลี่ยนปลายไมโครปิเปตต์เป็นปลายที่กำหนดไว้สำหรับสารละลายนั้น ๆ ก่อนการถ่ายสารทุกครั้ง และนำกลับไปวางไว้ที่เดิมหลังใช้งาน ภาพที่ 5 - การจัดวางปลายไมโครปิเปตต์สำหรับสารละลายแต่ละชนิด (โดยผู้วิจัย) การปรับเทียบสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ 1. ใช้ไมโครปิเปตต์ถ่ายสารละลาย ONPG ปริมาตร 1760 μL (1000 μL + 760 μL) และน้ำกลั่น 200 μL จากระบบให้ความร้อนแบบสองชั้นลงในคิวเวตต์ตามลำดับ 2. ปิดฝาคิวเวตต์และคว่ำกลับไปมาเบา ๆ 6 ครั้ง โดยระวังไม่ให้เกิดฟองอากาศ 3. เปิดสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ Vernier Go Direct SpectroVis Plus 4. ใช้คอมพิวเตอร์โน้ตบุ๊กและซอฟต์แวร์ Vernier Spectral Analysis เชื่อมต่อกับสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ผ่านบลูทูธ และเลือก “Absorbance vs. Time (Kinetics)” 5. ปฏิบัติตามคำแนะนำของโปรแกรม โดยรอให้สเปกโทรโฟโตมิเตอร์อุ่นเครื่อง ใส่คิวเวตต์ที่เตรียมไว้ และกดปรับเทียบ ตั้งค่าความยาวคลื่นที่ 420 nm และยืนยันว่าค่าพื้นฐานอ่านได้ 0 AU การทดลองชุดควบคุม 1. หลังการปรับเทียบ ใช้ไมโครปิเปตต์ถ่ายสารละลาย ONPG ปริมาตร 1760 μL (1000 μL + 760 μL) และน้ำกลั่น 200 μL จากระบบให้ความร้อนแบบสองชั้นลงในคิวเวตต์ตามลำดับ 2. ใช้ไมโครปิเปตต์ถ่ายสารละลายแล็กเทส 40 μL ลงในคิวเวตต์ และเริ่มจับเวลาด้วยนาฬิกาจับเวลาพร้อมกัน 3. ปิดฝาคิวเวตต์และคว่ำกลับไปมาเบา ๆ 6 ครั้ง เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดฟองอากาศ 4. เตรียมคิวเวตต์อีกอันหนึ่งโดยใช้ไมโครปิเปตต์ถ่ายสารละลาย ONPG ปริมาตร 1760 μL (1000 μL + 760 μL) และน้ำกลั่น 200 μL จากระบบให้ความร้อนแบบสองชั้นลงในคิวเวตต์ 5. เมื่อครบ 2 นาที ใช้ไมโครปิเปตต์ถ่ายสารละลายแล็กเทส 40 μL ลงในคิวเวตต์ 6. ปิดฝาคิวเวตต์และคว่ำกลับไปมาเบา ๆ 6 ครั้ง เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดฟองอากาศ 7. ทำซ้ำขั้นตอนที่ 4-6 อีกสามการทดลอง โดยให้แต่ละการทดลองเริ่มห่างกัน 2 นาที 8. เมื่อแต่ละการทดลองเกิดปฏิกิริยาครบ 20 นาทีแล้ว ใส่คิวเวตต์ลงในสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ และบันทึกค่าการดูดกลืนแสงที่ 420nm 9. ล้างคิวเวตต์และฝาทั้งหมดด้วยน้ำกลั่น
Suriyamas 7 การทดลองชุดทดลอง 1. ปฏิบัติตามขั้นตอนในหัวข้อ “การปรับเทียบเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์” โดยใช้สารละลายฟรักโทส 20.00mM แทนน้ำกลั่น 2. ดำเนินการตามขั้นตอนที่ 1-9 ในหัวข้อ “การทดลองชุดควบคุม” โดยใช้สารละลายฟรักโทส 20.00mM แทนน้ำกลั่น 3. ทำซ้ำขั้นตอนที่ 1-2 กับสารละลายฟรักโทส 40.00 mM, 60.00 mM, 80.00 mM และ 100.00 mM ความปลอดภัย: - เครื่องแก้วอาจแตกเป็นเศษแหลมคมและทำให้ได้รับบาดเจ็บร้ายแรง ดังนั้นต้องสวมถุงมือ เสื้อคลุมปฏิบัติการ และแว่นตานิรภัย และต้องเก็บเศษแก้วที่แตกด้วยไม้กวาดและที่ตักผง แล้วทิ้งลงในภาชนะสำหรับทิ้งแก้วที่กำหนดไว้ - ONPG และออร์โท-ไนโตรฟีนอลเป็นสารเคมีที่ก่อการระคายเคืองและเป็นอันตรายหากกลืนกินหรือสัมผัสผิวหนังหรือดวงตา (National Center for Biotechnology Information) จึงต้องสวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) ตลอดเวลา และควรล้างบริเวณที่สัมผัสสารทันทีด้วยน้ำไหล - เตาให้ความร้อน (hot plate) ต้องทำงานที่อุณหภูมิสูงกว่า 37 °C เพื่อรักษาอุณหภูมิที่กำหนดในชุดอุ่นแบบหม้อสองชั้น (double boiler) จึงมีความเสี่ยงที่จะเกิดแผลไหม้ ในระหว่างที่ใช้งานเตา ควรดำเนินการทดลองที่ฝั่งตรงข้ามของโต๊ะปฏิบัติการเพื่อหลีกเลี่ยงการสัมผัสโดยไม่ได้ตั้งใจ ข้อกังวลด้านสิ่งแวดล้อม: ONPG เป็นพิษต่อสิ่งมีชีวิตในน้ำ ดังนั้นของเสียทั้งหมดจะถูกเก็บรวบรวมและกำจัดตามแนวปฏิบัติด้านของเสียสารเคมีของโรงเรียน (Ibrahim et al.; Edvotek) ข้อกังวลด้านจริยธรรม: ไม่มีข้อกังวลด้านจริยธรรม เนื่องจากการทดลองนี้ใช้เพียงเอนไซม์ที่จัดหาจากแหล่งจำหน่ายเชิงพาณิชย์ และไม่มีการใช้มนุษย์หรือสัตว์เป็นผู้ถูกทดลอง ข้อมูลดิบ: ข้อมูลเชิงคุณภาพ: ● เมื่อความเข้มข้นของฟรักโทสเพิ่มขึ้น ความเข้มของสีเหลืองที่เกิดขึ้นหลังจาก 20 นาทีจะจางลงตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการเกิดออร์โท-ไนโตรฟีนอลลดลง ● สารละลายชุดควบคุมเปลี่ยนเป็นสีเหลืองเข้ม ในขณะที่สารละลายที่มีความเข้มข้นของฟรักโทสสูงกว่ามีสีเหลืองอ่อนจนเกือบใส ● ที่ความเข้มข้นของฟรักโทสสูง (80-100 mM) การเกิดสีดูเหมือนจะช้ากว่า โดยสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงได้น้อยกว่าในช่วงแรกของปฏิกิริยา ● ค่าการดูดกลืนแสงถูกบันทึกโดยอัตโนมัติทุก ๆ สองวินาที ความคลาดเคลื่อนเล็กน้อยของจังหวะเวลาในการทดลองที่เริ่มต่างเวลากันอาจทำให้ข้อมูลแปรผันไปเล็กน้อย
Suriyamas 8 ข้อมูลเชิงปริมาณ: ตารางที่ 1 - ตารางข้อมูลดิบของค่าการดูดกลืนแสงที่วัดที่ 420nm สำหรับฟรักโทสแต่ละความเข้มข้น ความเข้มข้นของฟรักโทส (mM) ค่าการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น AU (± 0.001 AU) การทดลองครั้งที่ 1 การทดลองครั้งที่ 2 การทดลองครั้งที่ 3 การทดลองครั้งที่ 4 การทดลองครั้งที่ 5 0 0.145 0.150 0.142 0.147 0.144 20 0.123 0.126 0.131 0.124 0.122 40 0.109 0.112 0.108 0.110 0.107 60 0.090 0.093 0.099 0.091 0.088 80 0.081 0.082 0.078 0.081 0.084 100 0.070 0.066 0.062 0.064 0.061 ข้อมูลที่ผ่านการประมวลผล: ตารางที่ 2 - ตารางข้อมูลที่ผ่านการประมวลผลของค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และร้อยละความไม่แน่นอนรวมของค่าการดูดกลืนแสง ความเข้มข้นของฟรักโทส (mM) ค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น (± 0.001 AU) ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ร้อยละความไม่แน่นอนรวมของค่าการดูดกลืนแสง (%) 0 0.147 0.00305 8.46 20 0.125 0.00356 8.58 40 0.109 0.00192 8.70 60 0.092 0.00421 8.87 80 0.081 0.00217 9.02 100 0.065 0.00358 9.32 ตัวอย่างการคำนวณสำหรับฟรักโทสความเข้มข้น 40 mM: ตารางที่ 3 - ตัวอย่างการคำนวณค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงของฟรักโทสความเข้มข้น 40 mM ค่าเฉลี่ย 𝑥( ) 𝑥 = 𝑖=1 𝑛 ∑ 𝑥𝑖 𝑛 𝑥 = 0.109 + 0.112 + 0.108 + 0.110 + 0.107 5 AU𝑥 ≈ 0. 109
Suriyamas 9 ตารางที่ 4 - ตัวอย่างการคำนวณส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของฟรักโทสความเข้มข้น 40 mM ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน σ( ) σ = 𝑖=1 𝑛 ∑ (𝑥𝑖−𝑥)2 𝑛 σ = (0.109 − 0.109)2 + (0.112 − 0.109)2+ (0.108 − 0.109)2+ (0.110 − 0.109)2+ (0.107 − 0.109)2 5 σ ≈ 0. 00192 ตารางที่ 5 - ตัวอย่างการคำนวณร้อยละความไม่แน่นอนรวมของค่าการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้นของฟรักโทสความเข้มข้น 40 mM การคำนวณค่าการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น การแผ่ของร้อยละความไม่แน่นอน (ร้อยละความไม่แน่นอนรวม) ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = ∆𝑉𝑂𝑁𝑃𝐺 𝑉𝑂𝑁𝑃𝐺 + ∆𝑉𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑒 𝑉𝐹𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑒 + ∆𝑉𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑉𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑠𝑒 + ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑆𝑝𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝐴𝑣𝑒𝑟𝑎𝑔𝑒 ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = ∆𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡𝑡𝑒 ×2 1760 + ∆𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡𝑡𝑒 200 + ∆𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡𝑡𝑒 40 + ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒𝑆𝑝𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑝ℎ𝑜𝑡𝑜𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 0.109 ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = 2.5×2 1760 + 2.5 200 + 2.5 40 + 0.001 0.109 ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = 0. 00284090909 + 0. 0125 + 0. 0625 + 0. 00917431192 ∆𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 = 0. 08701522101 ≈ 8. 70% ตารางที่ 6 - ตัวอย่างการคำนวณเกณฑ์ขอบล่างและขอบบนสำหรับค่าผิดปกติในข้อมูลดิบของฟรักโทสความเข้มข้น 40 mM การคำนวณเกณฑ์สำหรับค่าผิดปกติ ควอร์ไทล์ที่หนึ่งและควอร์ไทล์ที่สาม (Q1) และ (Q3) คำนวณโดยใช้ฟังก์ชัน 1-Var Stats บนเครื่องคิดเลขกราฟ TI-84 หลังจากป้อนชุดข้อมูลทั้งหมดที่เรียงลำดับแล้วจากตารางที่ 1 ,𝑄1 = 0. 081 𝑄3 = 0. 124 𝐼𝑄𝑅 = 𝑄3 − 𝑄1 𝐼𝑄𝑅 = 0. 124 − 0. 081 𝐼𝑄𝑅 = 0. 043
Suriyamas 10 การคำนวณเกณฑ์ขอบล่าง: 𝐿𝑜𝑤𝑒𝑟 𝑇ℎ𝑟𝑒𝑠ℎ𝑜𝑙𝑑 = 𝑄1 − (1. 5 × 𝐼𝑄𝑅) 𝐿𝑜𝑤𝑒𝑟 𝑇ℎ𝑟𝑒𝑠ℎ𝑜𝑙𝑑 = 0. 081 − (1. 5 × 0. 043) AU𝐿𝑜𝑤𝑒𝑟 𝑇ℎ𝑟𝑒𝑠ℎ𝑜𝑙𝑑 = 0. 017 การคำนวณเกณฑ์ขอบบน: 𝑈𝑝𝑝𝑒𝑟 𝑇ℎ𝑟𝑒𝑠ℎ𝑜𝑙𝑑 = 𝑄3 + (1. 5 × 𝐼𝑄𝑅) 𝑈𝑝𝑝𝑒𝑟 𝑇ℎ𝑟𝑒𝑠ℎ𝑜𝑙𝑑 = 0. 124 + (1. 5 × 0. 043) AU𝑈𝑝𝑝𝑒𝑟 𝑇ℎ𝑟𝑒𝑠ℎ𝑜𝑙𝑑 = 0. 189 การทดสอบนัยสำคัญทางสถิติ: ได้ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (one-way ANOVA) จาก Social Science Statistics เพื่อเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยของหกกลุ่ม ซึ่งรวมถึงชุดควบคุม โดยใช้ระดับนัยสำคัญ 0.05 ผลการวิเคราะห์ได้ค่า p < 0.001 ซึ่งบ่งชี้ว่าความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติและไม่น่าจะเกิดจากความบังเอิญ และชี้ให้เห็นถึงความสัมพันธ์เชิงเหตุและผลระหว่างความเข้มข้นของฟรักโทสกับค่าการดูดกลืนแสง ซึ่งสะท้อนการย่อยแล็กโทส (Stangroom) กราฟ: ภาพที่ 6 - กราฟแสดงความเข้มข้นของฟรักโทส (mM) กับค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น (AU) (จัดทำโดยผู้วิจัยด้วย Logger Pro) กราฟแสดงความสัมพันธ์เชิงเส้นในทางลบอย่างชัดเจนระหว่างความเข้มข้นของฟรักโทส (mM) กับค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้น (AU) การถดถอยเชิงเส้นแสดงให้เห็นสหสัมพันธ์เชิงลบที่สูงมาก (R² = −0.9955) ซึ่งสนับสนุนสมมติฐานที่ว่าความเข้มข้นของฟรักโทสที่สูงขึ้นทำให้การย่อย ONPG ลดลง
Suriyamas 11 สรุปผล: ข้อมูลที่ได้จากการทดลองของผู้วิจัยแสดงความสัมพันธ์เชิงลบอย่างชัดเจนระหว่างความเข้มข้นของฟรักโทสกับการไฮโดรไลซิส ONPG โดยแล็กเทส ค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงที่ 420 nm ลดลงตามลำดับจาก 0.147 AU ที่ฟรักโทส 0 mM เป็น 0.065 AU ที่ฟรักโทส 100 mM (ดูตารางที่ 2) ซึ่งคิดเป็นการลดลงของการผลิตออร์โท-ไนโตรฟีนอล 55.8% ตลอดช่วงที่ทดสอบ แนวโน้มนี้ได้รับการสนับสนุนอย่างหนักแน่นจากการถดถอยเชิงเส้น ซึ่งมีค่า R2 เท่ากับ −0.9955 บ่งชี้ว่าความแปรปรวนของค่าการดูดกลืนแสง 99.55% เป็นผลมาจากการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของฟรักโทส การทดสอบการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวยังได้ค่า p-value = < 0.001 ซึ่งต่ำกว่าเกณฑ์วิกฤต p ≤ 0.05 อย่างมาก ยืนยันว่าข้อมูลที่เก็บรวบรวมได้มีนัยสำคัญทางสถิติและไม่น่าจะเป็นผลจากความแปรผันแบบสุ่ม นอกจากนี้ ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของทุกกลุ่มอยู่ในช่วง ±0.00192 ถึง ±0.00421 AU และร้อยละความไม่แน่นอนรวมอยู่ในช่วง 8.46% ถึง 9.32% (ดูตารางที่ 2) แม้ว่าร้อยละความไม่แน่นอนเหล่านี้จะค่อนข้างสูง แต่แนวโน้มที่มีทิศทางสม่ำเสมอในฟรักโทสทั้งห้าความเข้มข้น และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานที่ต่ำภายในแต่ละกลุ่ม ชี้ให้เห็นว่าความแปรผันดังกล่าวไม่ได้ทำให้ข้อสรุปอ่อนลง ดังนั้นจึงปฏิเสธสมมติฐานว่างและยอมรับสมมติฐานแย้ง ผลการทดลองของผู้วิจัยสอดคล้องกับกลไกที่เป็นที่ยอมรับแล้ว ซึ่งฟรักโทสทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งแบบแข่งขันต่อการย่อยแล็กโทส ตัวอย่างเช่น งานวิจัยในปี 2013 ของ Song et al. ได้ศึกษาการสังเคราะห์แล็กทูโลสจากแล็กโทสในเวย์ด้วยเอนไซม์ และผลเชิงจลนศาสตร์ของน้ำตาลชนิดต่าง ๆ ต่อกิจกรรมของแล็กเทส ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าฟรักโทสทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งแบบแข่งขัน ดังที่แสดงในกราฟ Lineweaver-Burk ซึ่งความเข้มข้นของฟรักโทสที่เพิ่มขึ้นทำให้ค่าคงที่มิคาเอลิส (Km) เพิ่มขึ้นโดยไม่เปลี่ยนแปลงอัตราเร็วสูงสุดของปฏิกิริยา (Vmax) (Song et al.) รูปแบบทางจลนศาสตร์นี้เป็นลักษณะเฉพาะของการยับยั้งแบบแข่งขัน และยืนยันว่าฟรักโทสแข่งขันกับแล็กโทสโดยตรงในการเข้าจับบริเวณเร่งของเอนไซม์ (Strelow et al.) งานวิจัยอีกชิ้นหนึ่งซึ่งดำเนินการโดย Alpers และ Cote (1971) ใช้วิธีการเพอร์ฟิวชันในสิ่งมีชีวิต (in vivo) ในลำไส้ของหนูแรท เพื่อวัดการไฮโดรไลซิสแล็กโทสเมื่อมีน้ำตาลชนิดอื่นจากอาหารอยู่ด้วย ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าฟรักโทสเป็นตัวยับยั้งการไฮโดรไลซิสแล็กโทสที่มีประสิทธิภาพสูงภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา ซึ่งสอดคล้องกับการยับยั้งแบบแข่งขันที่สังเกตได้ในห้องปฏิบัติการ (Alpers and Cote) ข้อมูลนี้เป็นการยืนยันทางสรีรวิทยาที่หนักแน่นสำหรับการทดลองของผู้วิจัย เนื่องจากยืนยันว่าการรบกวนที่ผู้วิจัยสังเกตได้เป็นสิ่งที่เกิดขึ้นจริงและมีการบันทึกไว้แล้วในกระบวนการย่อยอาหาร ซึ่งความเข้มข้นของน้ำตาล เช่น ฟรักโทส ที่ผิวลำไส้ ส่งผลโดยตรงต่อประสิทธิภาพในการย่อยสลายแล็กโทส การประเมินผล: ในการศึกษานี้ ได้ทดสอบฟรักโทสห้าความเข้มข้นที่แตกต่างกัน ร่วมกับชุดควบคุม โดยเพิ่มขึ้นทีละ 20.00 mM แม้ว่าช่วงนี้จะเพียงพอสำหรับการแสดงแนวโน้มการยับยั้งที่ชัดเจน แต่การเพิ่มความละเอียดของตัวแปรต้นจะช่วยให้แสดงจลนศาสตร์ของการยับยั้งได้ละเอียดยิ่งขึ้น ตัวอย่างเช่น โดยการเพิ่มขึ้นทีละ 10.00 mM หรือขยายช่วงไปจนถึง 200.00 mM จุดข้อมูลที่หนาแน่นขึ้นนี้จะช่วยให้การวัดแม่นยำยิ่งขึ้น และสามารถระบุความเข้มข้นที่ผลการยับยั้งเริ่มคงที่ได้ ซึ่งจะให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับลักษณะการแข่งขันของการยับยั้ง นอกจากนี้ ช่วงที่กว้างขึ้นจะช่วยให้สามารถเปรียบเทียบเชิงปริมาณกับผลการค้นพบทางวิทยาศาสตร์ที่เป็นที่ยอมรับเกี่ยวกับค่า Km และ Vmax ได้มากขึ้น แม้ว่าจะไม่พบค่าผิดปกติที่มีนัยสำคัญในข้อมูลดิบ (ดูตารางที่ 6) แต่ร้อยละความไม่แน่นอนของแต่ละจุดข้อมูลค่อนข้างสูง โดยอยู่ในช่วง 8.46% ถึง 9.32% (ดูตารางที่ 2) ซึ่งเกิดขึ้นเป็นหลักจากความไม่แน่นอน 6.25% ที่เกี่ยวข้องกับการใช้ไมโครปิเปตดูดแล็กเทสปริมาตร 40 μL (ดูตารางที่ 5) ซึ่งเป็นแหล่งที่มาของความคลาดเคลื่อนที่อาจเกิดขึ้นมากที่สุดในการออกแบบการทดลอง
Suriyamas 12 แหล่งที่มาของความคลาดเคลื่อน ความคลาดเคลื่อน ความสำคัญ แนวทางปรับปรุง ปริมาตรของเอนไซม์แล็กเทสในสารละลายสุดท้าย (ความคลาดเคลื่อนเชิงระบบที่มีนัยสำคัญ) การปิเปตแล็กเทส 40 μL ซึ่งมีความไม่แน่นอน ±2.5 μL (~6.25%) อาจทำให้ความเข้มข้นของเอนไซม์เปลี่ยนแปลงไป ส่งผลต่อการไฮโดรไลซิส ONPG และค่าการดูดกลืนแสง เจือจางสารละลายแล็กเทสตั้งต้นเพื่อให้สามารถปิเปตในปริมาตรที่มากขึ้นได้ และปรับความเข้มข้นของฟรักโทสและ ONPG ให้สอดคล้องกัน เพื่อคงองค์ประกอบสุดท้ายของปฏิกิริยาตามที่กำหนดไว้ ความผันผวนของอุณหภูมิในชุดอุปกรณ์ต้มแบบสองชั้น (double boiler) (ความคลาดเคลื่อนเชิงระบบระดับปานกลาง) การควบคุมชุดอุปกรณ์ต้มแบบสองชั้นให้อยู่ที่ 37 °C (±0.5 °C) ด้วยมืออาจทำให้เกิดความผันผวนเล็กน้อยซึ่งส่งผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์อย่างไม่ได้สัดส่วน (LibreTexts) ใช้อ่างน้ำที่ควบคุมอุณหภูมิด้วยเทอร์โมสตัทเพื่อให้อุณหภูมิคงที่ที่ 37°C ตลอดการบ่ม ความล่าช้าระหว่างการบ่มและการวัดค่าการดูดกลืนแสง (ความคลาดเคลื่อนแบบสุ่มระดับปานกลาง) ความล่าช้าในการย้ายคิวเวตต์อาจทำให้ปฏิกิริยายังคงดำเนินต่อไป ส่งผลให้ค่าการดูดกลืนแสงเปลี่ยนแปลง หยุดปฏิกิริยาทันทีหลังจากทำปฏิกิริยาครบ 20 นาทีโดยใช้โซเดียมคาร์บอเนต การกวนที่ไม่สม่ำเสมอระหว่างการเตรียมสารผสมของปฏิกิริยา (ความคลาดเคลื่อนแบบสุ่มระดับเล็กน้อย) การกวนด้วยมืออาจทำให้สารละลายแล็กเทส ONPG และฟรักโทสกระจายตัวไม่สม่ำเสมอ ทำให้ความเข้มข้นเฉพาะที่แตกต่างกันเล็กน้อย และส่งผลต่อจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ในแต่ละการทดลอง ใช้เครื่องกวนแม่เหล็กเป็นระยะเวลาที่กำหนด (10s) เพื่อให้การผสมเป็นเนื้อเดียวกันและสารละลายทั้งหมดกระจายตัวอย่างสม่ำเสมอก่อนนำไปใช้ในปฏิกิริยา การระเหยของของเหลวที่ 37 °C ระหว่างการบ่ม (ความคลาดเคลื่อนเชิงระบบระดับเล็กน้อย) การระเหยที่ 37 °C อาจทำให้ความเข้มข้นของสารตั้งต้นและค่าการดูดกลืนแสงเพิ่มขึ้นเล็กน้อย ปิดหลอดทดลองทุกหลอดด้วยจุกปิดขณะอยู่ในชุดอุปกรณ์ต้มแบบสองชั้น เพื่อลดการระเหยและรักษาความเข้มข้นของสารละลายให้คงที่ การขยายผลการศึกษา: ศึกษาว่าการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของสับสเตรต ONPG เทียบกับความเข้มข้นของฟรักโทสที่คงที่จะส่งผลต่ออัตราการเกิดปฏิกิริยาอย่างไร ซึ่งเป็นการต่อยอดจากวิธีการในปัจจุบันที่กำหนดให้ ONPG คงที่ที่ 5 mM จากข้อมูลนี้ ผู้วิจัยยังสามารถคำนวณค่าคงที่มิคาเอลิส (Km) และความเร็วสูงสุด (Vmax) ผ่านกราฟไลน์วีเวอร์-เบิร์ก (Lineweaver-Burk plot) เพื่อยืนยันลักษณะการยับยั้งแบบแข่งขันในเชิงคณิตศาสตร์ การศึกษาอีกแนวทางหนึ่งอาจสำรวจว่าความแรงในการยับยั้งของฟรักโทสผันแปรอย่างไรภายใต้ปัจจัยกดดันทางสิ่งแวดล้อมที่ไม่เหมาะสม เช่น ระดับ pH และอุณหภูมิที่แตกต่างกันซึ่งพบได้ตลอดทางเดินอาหาร โดยก้าวข้ามสภาวะ pH 7.0 และ 37°C ที่ควบคุมอย่างเคร่งครัดในการศึกษานี้
เอกสารอ้างอิง Alpers, David H., and Marilyn N. Cote. “Inhibition of Lactose Hydrolysis by Dietary Sugars.” American Journal of Physiology, vol. 221, no. 3, Sept. 1971, pp. 865–868, pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/5570344/, https://doi.org/10.1152/ajplegacy.1971.221.3.865. Edvotek. “SDS – ONPG.” Edvotek, 14 May 2025, www.edvotek.com/site/pdf/ONPG.pdf?srsltid=AfmBOopPP7UBX_lEPbGb1_MECsh3gJ PDYVcqrHxbqki4A5pyBaCsR3tA. Goosenberg, Eric, and Muriam Afzal. “Lactose Intolerance.” National Library of Medicine, National Institutes of Health, 2023, www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK532285/. Ibrahim, Yunus, et al. “Characterization of a Molybdenum-Reducing Bacterium with the Ability to Degrade Phenol, Isolated in Soils from Egypt.” BioTechnologia, vol. 96, no. 3, Jan. 2015, pp. 234–245, www.researchgate.net/publication/292355848_Characterization_of_a_molybdenum-redu cing_bacterium_with_the_ability_to_degrade_phenol_isolated_in_soils_from_egypt, https://doi.org/10.5114/bta.2015.56573. Leksmono, Cattleya S., et al. “Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.” Journal of Visualized Experiments, vol. 138, 6 Aug. 2018, www.researchgate.net/publication/326866705_Measuring_Lactase_Enzymatic_Activity_ in_the_Teaching_Lab, https://doi.org/10.3791/54377. MedlinePlus. “LCT Gene: MedlinePlus Genetics.” Medlineplus.gov, 24 Mar. 2023, medlineplus.gov/genetics/gene/lct/#conditions.
National Center for Biotechnology Information. “PubChem Compound Summary for CID 96647, Nitrophenylgalactosides.” PubChem, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Nitrophenylgalactosides. Accessed 28 Feb. 2026. Popescu, Liliana, et al. “Effect of Temperature, PH and Amount of Enzyme Used in the Lactose Hydrolysis of Milk.” Food and Nutrition Sciences, vol. 12, no. 12, Dec. 2021, pp. 1243–1254, scirp.org/journal/paperinformation.aspx?paperid=114047, https://doi.org/10.4236/fns.2021.1212091. Song, Yoon Seok, et al. “Batch and Continuous Synthesis of Lactulose from Whey Lactose by Immobilized β-Galactosidase.” Food Chemistry, vol. 136, no. 2, 15 Jan. 2013, pp. 689–694, www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814612013684, https://doi.org/doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.08.074. Stangroom, Jeremy. “Social Science Statistics.” Social Science Statistics, 2026, www.socscistatistics.com/tests/anova/calculator/. Strelow, John, et al. “Mechanism of Action Assays for Enzymes.” National Center for Biotechnology Information, 1 Oct. 2012, www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92001/. VanDee, Lauren, et al. “A Cost‐Effective Enzyme Kinetics and Inhibition Model for Biochemistry Education and Research.” Biochemistry and Molecular Biology Education, vol. 52, no. 5, 15 June 2024, https://doi.org/10.1002/bmb.21845. Verducci, Marco. “Optimal Conditions for the Efficacy of the Lactase Enzyme - Scientific Article.” Lactosolution, 5 May 2018, www.lactosolution.com/en/blog/lactase/optimal-conditions-for-the-efficacy-of-the-lactase -enzyme-scientific-article.